Voleu conèixer novetats dels biofilms?

Els biofilms, aprenentatges darrera el Biofilm Summit de la fira FoodTech.

La informació d'aquest post prové de les conferències que els experts participants en el Biofilm Summit (que va tenir lloc després d’Alimentaria 2018) van compartir amb els participants (i l'autora d'aquest post era entre ells).

Ja sabeu que estic dedicada a elaborar materials que vinculen seguretat alimentària i neteja i desinfecció per a l'empresa Papelmatic, ara en col·laboració amb Itram Higiene; la meva assistència al Biofilm Summit va ser facilitada per Papelmatic.

La voluntat d’aquesta nova comunicació és fer arribar conceptes innovadors relacionats amb l’ecologia i la vida microbiana a totes les persones responsables de vetllar per la gestió eficient del risc alimentari derivat dels perills microbiològics.

Resumeixo el concepte de biofilm per avançar a partir d’aquí i aprofito la il·lustració del biofilm de Pseudomonas aeruginosa que ens mostra la Viquipèdia, ja que és força il·lustratiu.

Apareixen 5 fases en el desenvolupament del biofilm, de manera que la fase 5 permet tornar a iniciar el cicle amb la fase1:

1. Fixació inicial, fase reversible si el procés de neteja i desinfecció és eficient. Les cèl·lules que veiem aïllades en el cercle vermell s’anomenen cèl·lules planctòniques, i tenen un comportament diferent a les mateixes cèl·lules quan viuen en comunitat (fase 4).
2. Fixació irreversible, les cèl·lules planctòniques es comencen a recobrir d’una pel·lícula de polisacàrids que li proporciona seguretat i aliment; de vegades les cèl·lules de la capa inferior se sacrifiquen perquè sobre seu s’adhereixin noves cèl·lules planctòniques.
3. Maduració I: la ràpida multiplicació bacteriana va fent créixer la comunitat sota la biopel·lícula.
4. Maduració II: a mesura que creix la comunitat apareixen zones especialitzades per mantenir-la, com ara canals d’aigua (cercles verds) que li han de permetre continuar el creixement.
5. Dispersió: la ruptura “natural” de la biopel·lícula per exhauriment de nutrients i necessitat de colonitzar nous indrets o “provocada” per fricció en la neteja, per exemple, provoca l’alliberament de noves cèl·lules planctòniques (cercle vermell) amb total capacitat per seguir la fletxa negra i contaminar/colonitzar nous espais.

I tot això no ho vell l’ull humà; de vegades podem olorar-ne la presència, però és difícil.

ON SE SOLEN AMAGAR ELS BIOFILMS PER AFECTAR LA INDÚSTRIA ALIMENTÀRIA?

• Els biofilms poden créixer en dutxes molt fàcilment, ja que proporcionen un ambient humit i càlid perquè la biopel·lícula creixi. Per això, els bacteris del gènere Legionella creixen sota certes condicions en biopel·lícules, en les quals es protegeixen contra els desinfectants. Els treballadors en torres de refrigeració, les persones que treballaven en espais propers a fonts decoratives i la gent que pren una dutxa estan exposades a patir legionel·losi en aspirar aerosols, que transporten el bacteri; això sempre que els sistemes no es mantinguin apropiadament. Aquest és el motiu pel qual una indústria alimentària amb sistema de refrigeració ha de portar el control de Legionella, per salut pública.
• Els biofilms es poden desenvolupar en l’interior de conduccions i causar corrosió i obstruccions. Quan s’adhereixen a terres i superfícies de treball (coma ara taulells i equips) poden ser difícils de sanejar en àrees de preparació alimentària (que solen ser humides i amb molta matèria orgànica). Se sap que els biofilms en equips intercanviadors de calor o refrigeradors redueixen l’eficàcia energètica, per tant els pasteuritzadors es poden veure afectats no oferint el binomi òptim (dades que havia validat el fabricant de l’equip) de temps/temperatura que assegura la innocuïtat alimentària.

També tenim biofilms beneficiosos com ara: els que poden ajudar a eliminar oli de petroli d'oceans contaminats o sistemes marins, o en depuradores que inclouen un escenari de tractament en el qual les aigües residuals passen sobre biopel·lícules desenvolupades en filtres, que extreuen i digereixen composts orgànics.

En l’àmbit humà, la placa dental seria un biofilm i algunes de les malalties nosocomials (aquelles que s’adquireixen pel fet d’estar hospitalitzat), provocades per bacteris oportunistes, com ara Pseudomonas aeruginosa, en tenen l’origen en biofilms dins els conductes d’aire, en els tubs d’aspiració...

TOTES LES INDÚSTRIES ALIMENTÀRIES TENEN BIOFILMS?

Segurament moltes més de les que pensem. Fins i tots les empreses elaboradores de begudes refrescants (que per efecte del gas diòxid de carboni són àcides per naturalesa) tenen biofilms causats per llevats alterants.

Els patògens més habituals en la indústria alimentària que s’introdueixen en biofilms o en generen són: Salmonella, Listeria monocytogenes i Pseudomonas sp. Aquests perills microbiològics no són presents a les indústries de tots els sectors, però sí a moltes. A més, cal recordar que els biofilms creixen en funció de la matriu; si agafem per exemple carn, llet i caldo de cultiu (el vehicle en el qual es multipliquen microorganismes al laboratori), els biofilms creixeran més en la carn, després en la llet i finalment en el caldo de cultiu.

Això vol dir que és més fàcil tenir biofilms en superfícies d’indústries alimentàries mal higienitzades, que voler-los generar expressament en un tanc de laboratori.

Com que la millor manera de controlar el risc és evitar els perills, la millora manera de prevenir els biofilms és disposar d’equips amb disseny higiènic, és a dir, que disposin de materials fàcilment netejables i desinfectables, que siguin resistents a la corrosió, de superfícies llises ben polides i amb protecció dels aparells elèctrics annexos.

En aquest post arribarem fins a la manera de detectar-los mitjançant un bon mostreig; en el proper post ja identificarem com eliminar-los per garantir que no es tornen a reproduir.

PAUTES PER MOSTREJAR CORRECTAMENT SUPERFÍCIES I IDENTIFICAR LA PRESÈNCIA DE BIOFILMS

1. Cal mostrejar al cap de 3-4 d’haver netejat i desinfectat les superfícies, ja que els bacteris poden haver quedar inactivats pels desinfectants, però continuen vius i amb capacitat multiplicadora.
2. Cal que la mida de la superfície a mostrejar sigui més gran del que estem acostumats: per a patògens es recomanen entre 1.500-3.000 cm² (exemple per a Listeria en producció).
3. Cal que la freqüència de mostreig sigui variable en funció del risc del producte i de si hi ha brots implicats.
4. screening); posteriorment, si cal, ja es traçarà fins a nivell de soca en laboratori.
5. Cal disposar d’un pla de verificació (per monitorar) que inclogui: zones de difícil accés, forats negres, esquerdes...

Recordem que un resultat positiu és una oportunitat per evidenciar un problema i solucionar-lo; no ho hem de considerar com un fracàs del sistema, pot evidenciar problemes microbiològics passats.

COM ELIMINAR-LOS PER GARANTIR QUE NO ES TORNIN A REPRODUIR??

Un dels motius pels quals insistim en el tema dels biofilms, entre d'altres, rau en les opinions i recomanacions de l'OMS (la persistència mediambiental), que ens explica que les FBD (foodborne diseases) [en català MTA, malalties de transmissió alimentària i en castellà ETA, enfermedades de transmisión alimentaria] vinculen biofilms y trastorns digestius per contaminació encreuada; així per exemple: es pot establir una relació entre els microorganismes d'una planta de producció i l'aliment que produeix (persistència de Listeria en formatge fins a 7 anys i en pollastre fins a 12 anys).

A més, tenint en compte la percepció dels consumidors, en el rànquing del que més els preocupa en relació amb els aliments està, per aquest ordre: substàncies químiques > bacteris > frau (adulteració) > nous virus > noves tecnologies > noves tendències.

Anem a recordar alguns conceptes, amb l'ajuda de les preguntes que els experts de la sala van fer als ponents:

1. Inactivació no es el mateix que eliminació. Els estudis d'eliminació es fan amb cèl·lules aïllades de biofilm, és a dir, sense la capa polimèrica de protecció; d'aquesta forma una cèl·lula microbiana necessita la ½ de biocida. Així, després d'aplicar biocides (com ara ortoftalaldehído -OPA- que és efectiu perquè disminueix l'estabilitat del biofilm o dodecilsulfat sòdic -SDS- que augmenta l'estabilitat i per tant és més difícil d'eliminar) a les 3 hores l'estructura del biofilm es recupera: les tincions passen de vermell (cèl·lules mortes) a verd (cèl·lules vives) sobre el biofilm, i al cap de 12 hores totes les cèl·lules són ja viables (verdes).
2. La resistència dels bacteris als fàrmacs pot ser conseqüència de l'ús dels desinfectants mal emprats. Les concentracions subletals de biocides ensenyen els microorganismes a resistir a concentracions letals, per tant no moriran. L'incompliment de la concentració i el temps d'aplicació que el fabricant de biocides inclou en la fitxa tècnica (FT), encara que els assajos s'hagin efectuat sobre microorganismes lliures -no provinents de biofilms-, és una mala praxi. Hem de recordar que concentracions molt altes i a elevada temperatura fan malbé els equips, de manera que cal insistir a modificar la normativa europea per utilitzar condicions menys enèrgiques.
3. Els microorganismes de biofilms NO es veuen afectats per l'acció de conservants, tractaments tèrmics o altres additius. Els cnservants són bacteriostàtics no bactericides, per això no indueixen resistències (la cèl·lula no s'estressa tant). Uns 30 minuts d'aplicació d'un bactericida ja indueix un canvi en les proteïnes cel·lulars, un tractament tèrmic indueix un canvi que pot ser reversible. Així doncs, a > estrès > canvi.
4. L’efecte de les pistoles de neteja tipus Kärcher. Les sinergies entre l'efecte químic i l'efecte mecànic són bàsiques, però l'aigua a pressió elimina només la part externa del biofilm, després es necessita l'efecte residual del biocida per acabar amb cèl·lules alliberades del biofilm, que tenen memòria i es readapten més que les cèl·lules en suspensió. És preferible utilitzar sistemes no abrasius (ja que la força mecànica els dissemina), sistemes que debilitin l'estructura externa mitjançant una acció enzimàtica per passar de cèl·lules de biofilm a cèl·lules planctòniques.

CCOM PODEM DETECTAR/VEURE ELS BIOFILMS?

Se sap que, de l'avaluació entre els resultats analítics i la coincidència entre ambient i producte, entre salmó i ambient (per exemple), es van trobar coincidències genòmiques de 4 mesos a 2 anys; fins i tot hi ha estudis de durada de biofilms de fins a 10 anys.

Els mètodes clàssics de recuperació de microorganismes de les superfícies són:

• Plaques de contacte: per a superfícies grans, però hi ha variació per temperatura i pressió en l'execució.
• Turundes (100 cm² per a recompte): en superfícies complexes i humides.
• Esponges o baietes (d'elecció per a detecció): poden arrossegar, per tant millor; s'incuben directament o s'inoculen alíquotes en medi de cultiu. Hem de conèixer la dilució i el volum per passar a cm² o es fa una PCR (reacció en cadena de la polimerasa).

Altres tècniques preferents per a biofilms:

• SCH o sensors de control de higiene (los desarrolladores de los biosensors SCH són a Premiumlab (Aquesta adreça electrònica s'està protegint contra robots de correu brossa. Necessites JavaScript habilitat per veure-la. ): un disc encastat on creix directament el biofilm.

• Sistemas de tinció: actuen sobre la matriu extracel·lular del biofilm, no sobre las cèl·lules; es una determinació qualitativa i no regulada per la legislació.
• ATP, que no detecta viables, només MO (matèria orgànica, també dels aliments).

La legislació alimentària exigeix un aliment sense carrega microbiana (provingui de biofilm o no). La freqüència de mostreig ha de dependre de la velocitat de creixement del biofilm.

Quin seria el millor mètode? (recordeu que l’aïllament és la clau):

• Un de no microbiològic: ATP (barat, simple, bona sensibilitat, però que capta els orígens microbià i no microbià), proteïnes, visual, reductor de sucres; fer anàlisis de tendències es bàsic.
• Altres microbiològics: PCR, metagenòmica.

Després de la neteja i la desinfecció, el biofilm torna a créixer; detectar si està viu o mort no importa: una cèl·lula morta vol dir que hi ha més que poden estar vives. Per tant, resumim que els biofilms:

• estan implicats en la contaminació encreuada
• poden ser organismes residents o transitoris
• són una nova forma de vida microbiana
• han de tenir detecció microbiològica i no microbiològica

Un consell

Els estris de neteja són els millors transmissors de contaminació. Mireu de treballar amb estris de neteja higienitzables i/o d'un sol ús; a més el seguiment correcte del Pla de neteja i desinfecció perquè es compleixi la higienització de tots els estris és bàsic, tot i que costa. Els detergents i els biocides no fan miracles si les baietes caminen soles!

DESPRÉS DE LA DETECCIÓ, QUÈ?

Doncs hem d'eliminar el biofilm. Els investigadors de l'SCH han estat molt hàbils, ja que el creixement de biofilms en laboratori no és fàcil (per poder estudiar la seva ecologia i eliminar-los): han portat el laboratori a la planta de producció. Aquests discs portàtils són mostrejadors en continu: unes plaques d'alumini en envàs estèril que contenen 3 pouets amb cilindres de resina epoxi especial per al creixement de L. monocytogenes (teniu més informació al Journal of Microbiology 2018 i a Food Control d’Elsevier maig 2018 (articles del doctor José Juan Rodríguez).

Aquests discos es col·loquen estratègicament en zones de difícil accés per ser netejades de la vostra planta; el microorganisme que ens afecta creixerà en el sensor i si es transforma en biofilm queda adherit al sensor (creixement de biofilms a escala industrial, no en bioreactors). Retirarem els discos amb la freqüència que estimem més convenient i revelarem la seva concentració (fàcilment s'arriba a 10³).

Les solucions enzimàtiques d’ITRAM trenquen el biofilm. Després d'una neteja i desinfecció, el nombre d'aerobis i d’alterants disminueix; però en deixar de créixer els microorganismes competidors, els alterants es mantenen a ratlla. Per tant, després del tractament enzimàtic només es neteja, no es desinfecta (els aerobis augmenten, però el biofilm ja no es reprodueix).

Els investigadors han demostrat que les anàlisis microbiològiques de recompte (24-48 hores), d'ATP, de recompte automatitzat o de patògens per RT-PCR/microbiologia directa mostrejats en superfícies amb placa RODAC o escovilló, quan són negatius o retornen el recompte d’1 colònia, això equival a 10⁵ o 10⁶ en superfície, què vol dir?:

• La neteja convencional química deixa colònies vives a l'interior d'un biofilm, que poden recontaminar.
• La neteja enzimàtica + desinfecció suposa un 2 en 1 i un estalvi consegüent de temps.

Un consell

Les indústries amb resultats analítics de productes en dents de serra i resultats negatius de contaminació en superfícies poden pensar en l'existència de biofilms; aquestes empreses podrien provar la neteja enzimàtica.

La neteja i desinfecció químiques poden seguir sent efectives, ben aplicades, en indústries sense problemes de biofilms (més seques, en productes que tinguin una baixa activitat d'aigua -A_w-).

QUÈ POT PORTAR A TERME LA INDÚSTRIA ALIMENTÀRIA PER A GENERAR CONFIANÇA?

El que més valora el consumidor dels productes alimentaris és l'empatia: autenticitat, proximitat (conec la marca?, m'entenen?), responsabilitat, rellevància, innovació, i interacció. Per tant, les indústries alimentàries han de comunicar (el 61% de persones tenen un mòbil) i han d'actuar com ho fan les xarxes, amb aquesta empatia, transparència i rapidesa comunicant:

• La competència y el know how: formar als productors en origen
• La transparència: amb el control de la cadena de subministrament, que ara es molt complicada; cal treballar molt dur la traçabilitat (seqüenciació genòmica)
• L’escolta del consumidor (en xarxes)

MILLOR EVITAR EMBRUTAR QUE MILLORAR NETEJANT

I la cirereta del pastís: no us oblideu de vigilar i netejar les esquerdes de les lames plàstiques de cortines, perquè també hi viuen els biofilms.